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免疫印迹实验(western blotting)


    免疫印迹法是一种经由过程凝胶电泳星散蛋白质并经由过程电转移把蛋白质转移到吸附膜上。一经卵白印迹后,便可经由过程特异性的符号抗体检测到响应蛋白质。
    十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可用于检测已被SDS化学变性的卵白。但是,某些特定的抗体不会正在一个变性的蛋白质份子上辨认其抗原表位,这时候需求停止不露SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
    卵白印迹转膜能够经由过程湿法或半干法停止。正在前者,凝胶夹正在印迹膜和种种过滤装配中央,然后把全部装配埋进一个装满Tris转移缓冲的电极槽中。正在后者,夹正在中央的凝胶四周只要少许的缓冲液,然后关闭正在电极板之间。固然半干法转膜较快,但需求很好天拟合各部分的夹层配件,而湿法转膜很少会泛起题目,能够只管连结反复实行效果的一致性。另外,若是半干法转膜工夫过长,较小分子量的蛋白质可能会从膜上转过。
    转膜后,需对膜停止关闭,以削减非特同性卵白联合,然后停止用一抗孵育膜,以研讨感兴趣的目的卵白。单克隆抗体一般具有更高的特异性;但是很多单克隆抗体产生于某个特定肽段而不是一个自然蛋白质,因而能够没法检测到PAGE所星散的自然卵白。也可运用多克隆抗体,但易构成较下的配景值。果一抗一般无符号,以是需求一个能够联合正在一抗Fc段的符号的二抗,以用于最初的检测。一般会用酶来符号二抗。酶符号后的印迹可经由过程化学发光酶底物及放射自显影手艺成像。被抗体检测和符号到的蛋白质会泛起正在图象的暗区。
    雀斑印迹法类似于免疫印迹法,正在膜上检测目的卵白;然则雀斑印迹法中检测的蛋白质不消电泳停止星散。取而代之的是,含有目的卵白的样品被间接“点”到膜上,这不能做到定量检测,但它能够间接检测某种特定卵白的有没有。比方,雀斑印迹法可用于检测蔗糖梯度星散的细胞裂解产品中的某些蛋白质定位。

免疫印迹实验常见的题目及缘由

1、没有条带

能够存在的缘由

解决方法

抗体缺乏

抗体取卵白的亲和不下,加大抗体的浓度;抗体活性低落,雀斑实行。

卵白量缺乏

增添卵白的上样量;其他路子测定卵白含量;增加一个阳性对比;雀斑实行

卵白转移失利

PVDF:甲醇激活,NC和PVDF正在转膜液中浸泡;连结膜取胶之间的无气泡打仗。

卵白转移率低

优化转膜工夫,高分子量卵白能够需求更长的工夫,转膜以后能够用丽春红染色,并用预染的maker作为指导。

卵白转移透膜

低落电压大概工夫当分子量小于10kd时

等电点大于9

运用更高ph值的溶液系统(pH10.5)

二抗运用毛病

二抗的种属毛病

逾期的抗体

购置新抗体

抗体的不正确贮存

根据生产商手册,制止重复冻融

抗体的不正确贮存

制止二抗中含有叠氮钠,它能催眠HRP旌旗灯号

一抗联合工夫缺乏

4渡过夜孵育

2、微小的条带(weak single)

能够存在的缘由 解决办法
卵白取抗体联合率低

较少洗膜次数大概收缩洗膜工夫;

低落洗膜液中NaCl的浓度(0.15M-0.5M);

低落抗体稀释液中NaCl的浓度(0.15M-0.5M)
抗体量缺乏 抗体和卵白的联合较低,可将抗体浓度调解至初始浓度的2-4倍
卵白量缺乏 增添卵白上样量
酶和底物时效 将酶和底物停止回响反映,视察征象,泛起非常,则需求从新符号大概购置
逾期大概陈腐的ECL发光液 改换的新的ECL发光液
脱脂奶粉可能会掩饰一些抗原 低落牛奶的百分比大概用BSA替代

3、分外的条带(Extra Bands)
能够的缘由 解决方法
一抗的非特性联合 低落抗体浓度;削减总卵白的上样量;免疫亲和层析纯化抗体
二抗的非特同性联合 跑一个二抗的阴性对比(不孵育一抗);将二抗停止免疫亲和层析
一抗大概二抗的非同性联合 增加0.1%-0.5%的吐温20到抗体稀释也中;
用2%的脱脂奶粉消融抗体,并恰当调解抗体浓度;增添洗膜液中NaCl的浓度(0.15M-0.5M);增添洗膜工夫大概次数;
卵白散慢 进步DTT的浓度,加样前加热煮沸5-10min
卵白的降解 制止重复冻融;增加蛋白酶抑制剂;制备新颖样品;
试剂净化 设置新颖的给中溶液

4、下配景(High Background)

能够的缘由 解决办法
一抗的非特同性联合 免疫亲和层析纯化抗体;调解一抗稀释液中奶粉的百分比和NaCl的浓度;低落抗体浓度
二抗的非特同性联合 跑一个二抗的阴性对比(不孵育一抗);
关闭不充分 用TBST(pH7.5)配制5%的脱脂奶粉,调治个中吐温20的百分比和个中NaCl的浓度。吐温的转变局限0.1%-0.5%;NaCl的浓度局限是0.15M-0.5M;延伸关闭工夫
脱脂奶粉能够含有目的抗原 用5%的BSA替代
脱脂奶粉含有内源性生物素大概取抗生物素卵白/链霉亲和素不相溶 用5%的BSA替代
某些抗体能够辨认牛奶卵白 用5%的BSA替代
洗膜不充分 增添洗膜次数,进步吐温20 的百分比
过分暴光 收缩暴光工夫

5、 膜上散正在不均匀的污点
能够的缘由 解决办法
试剂净化 改换新颖的试剂
正在抗体孵育或洗膜中液体量不敷 确保正在抗体孵育和洗膜历程中,液体总量充足
转膜有气泡 再转膜历程中确保气泡排清洁
抗体孵育历程中显现不均匀散布 抗体配制匀称,最幸亏摇摆的条件下孵育
用具被净化 确保正在实行历程中一切用到用具装备要洗涤清洁
暴光工夫过长 收缩暴光工夫

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