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流式细胞术Flowcytometry

 

道理:流式细胞术(flowcytometry FCM)是对单个细胞或其他生物微粒停止快速定量分析和分选的一门手艺。正在剖析或分选历程中,包绕正在活动液体中处置惩罚过的单个细胞或微粒经由过程聚焦的光源,发生电信号,这些旌旗灯号代表光散射、荧光等参数,以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质,并可凭据这些性子分选出下纯度的细胞亚群,以对其进一步的造就或剖析。
运用:流式细胞术的功用决意了其正在免疫学根蒂根基研讨中的普遍运用,现在正在临床上重要用于细胞表型剖析、造血系肿瘤诊断和分型、移植前配型及取免疫有关疾病剖析等。
(1)FCM正在临床医学中运用
    淋巴细胞亚群剖析、血小板剖析、网织红细胞剖析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27表型剖析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中的运用、艾滋病的诊断取医治。
(2)FCM正在根蒂根基研讨中的运用
    淋巴细胞功用、树突状细胞研讨、造血干/祖细胞研讨、细胞周期剖析、细胞凋亡剖析、总卵白测定、细胞因子测定、细胞膜电位测定、胞内钙离子测定、细胞内pH测定、细胞内活性氧检测、蛋白质磷酸化检测、flow-FISH法测定端粒长度。
作为运用流式细胞术停止检测的手艺平台,当代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代。经由远四十年的生长和完美,今天的流式细胞仪曾经非常成熟,并被普遍的运用于从根蒂根基研讨到临床理论的各个方面,涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床磨练等范畴,正在各学科中施展偏重要的感化。

一、流式细胞抗原染色要领
    细胞表面抗原符号:细胞正在各自一般分化成熟的差别阶段和活化历程中,其细胞膜外面都可表达供判别的特别构造,即外面标记。流式细胞术正在细胞外面份子的检测取剖析重要应用于免疫细胞及其亚群的检测取功能分析;血液体系细胞外面标记的研讨;细胞群体及细胞外面标记转变的检测;细胞外面标记组成性子剖析。
    细胞内抗原符号细胞内或细胞核内染色联合流式细胞术剖析肯定某些细胞内细胞因子或卵白表达程度。剖析细胞内或细胞核内抗原的关键在于荧光符号的单克隆抗体能自在进入细胞内或细胞核内,且不克不及损坏细胞形状的完整性和连结细胞内靶抗原稳定。因而细胞内或核内染色的关键在于细胞流动和胞膜或核膜穿透。
A、表面抗原间接符号
1、将消化下来的细胞用1 X PBS洗两遍,然后用0.5 mL 0.5%BSA的 1 X PBS重悬。
2、到场等量预热的4%多聚甲醛流动细胞,37℃,10分钟。(可选步调)
3、用0.5%BSA的1 X PBS洗两遍。
4、3%BSA关闭。
5、样本符号:100μl 0.5%BSA的 1 X PBS内细胞量为0.5-1X106个
a)不符号细胞样本
b)同型对比
c)符号一抗
6、以抗体说明书上的比例到场抗体,冰上孵育30分钟。
7、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍。
8、到场500 μl 1 X PBS上机检测。
B、表面抗原直接符号
1、将消化下来的细胞用1 X PBS洗两遍,然后用0.5 mL 0.5%BSA的 1 X PBS重悬。
2、到场等量预热的4%多聚甲醛流动细胞,37℃,10分钟。(可选步调)
3、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍。
4、样本符号:100μl 0.5%BSA的 1 X PBS内细胞量为0.5-1X106个。
a)不符号细胞样本
b)零丁二抗
c)同型对比+二抗
d)一抗+二抗
5、以抗体说明书上的比例到场抗体,冰上孵育30分钟。
6、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍。
7、0.5%BSA的 1 X PBS重悬细胞后到场等体积10%山羊血清,室温孵育15分钟。
8、到场荧光符号二抗,安排冰上,避光条件下孵育30分钟。
9、用0.5%BSA的1 X PBS洗两遍。
10、到场500μl 1 X PBS上机检测。
C、胞内抗体间接符号
1、将消化下来的细胞用1 X PBS洗两遍,然后用0.5 mL 0.5%BSA的 1 X PBS重悬。
2、到场等量37℃预热的4%多聚甲醛流动细胞,37℃孵育10分钟。
3、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍并用1ml 90%的冰甲醇重悬细胞,安排冰上30分钟。
4、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍。
5、3%BSA关闭。
6、样本符号:100μl 0.5%BSA的 1 X PBS内细胞量为0.5-1X106个。
a)不符号细胞样本
b)同型对比
c)一抗
7、以抗体说明书上的比例到场抗体,冰上孵育30分钟。
8、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍。
9、到场500μl 1 X PBS上机检测。
D、胞内抗体直接符号
1、将消化下来的细胞用1 X PBS洗两遍,然后用0.5 mL 0.5%BSA的 1 X PBS重悬。
2、到场等量预热的4%多聚甲醛流动细胞,37℃孵育10分钟。
3、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍并用1ml 90%的冰甲醇重悬细胞,安排冰上30分钟。
4、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍。
5、样本符号:100μl 0.5%BSA的 1 X PBS内细胞量为5X105-1X106个。
a)不符号细胞样本
b)零丁二抗
c)同型对比+二抗
d)一抗+二抗
6、以抗体说明书上的比例到场抗体,冰上孵育30分钟。
7、用0.5%BSA的 1 X PBS洗两遍。
8、0.5%BSA的 1 X PBS重悬细胞后到场等体积10%山羊血清,室温孵育15分钟。
9、到场荧光符号二抗,安排冰上,避光条件下孵育30分钟。
10、用0.5%BSA的1 X PBS洗两遍。
11、到场500μl 1 X PBS上机检测。
     间接免疫荧光符号法 本要领操纵轻便,效果正确,易于剖析,适用于统一细胞群多参数同时测定。固然曲标抗体试剂本钱较下,但削减了直接符号法中较强的非特异荧光的滋扰,因而更适用于临床标本的检测。
直接免疫荧光符号法 本要领用度较低,二抗运用普遍,多用于科研标本的检测。但因为二抗一样平常为多克隆抗体,特异性较差,非特同性荧光配景较强,易影响实行效果。以是标本制备时应到场阴性或阳性对比。别的,因为间标法步调较多,增添了细胞的丧失,不实用测定细胞数较少的标本。

二、数据采集取剖析
      数据的显现一般可分为一维单参数直方图(histogramplot)、二维点图(dotplot)、二维等下图(contour)和假三维图(pseudo3D)等。最常用的是单参数直方图和二维点图。
1.单参数直方图
      用来停止定性分析和定量分析。横坐标示意荧光旌旗灯号或散射光旌旗灯号强度的相对值,其单元用“讲数”(channel)示意,横坐标能够是线性的,也能够是对数的。纵坐标一般代表细胞泛起的频次或相对细胞数。

博奥森1

单参数直方图

2.  二维点图
当需求研讨两个或更多丈量参数之间的干系时,可采用二维点图。二维点图有两种情势,横坐标示意前背散射光(FSC),反应细胞的巨细;纵坐标示意侧向散射光,反应细胞内颗粒的巨细和若干。坐标图上每一点同时示意具有响应坐标值的细胞存在。

博奥森2

二维点囤的细胞群框定 荧光单染色二维点图

 

三、流式抗体挑选尺度
1. 知足抗体挑选的基本条件
靶卵白特异性:肯定目标细胞的特异性外面符号大概胞内符号,晓得您要检测甚么。
种属:严厉根据待测样本种属挑选抗体泉源,流式抗体根基没法停止种属间交织回响反映。
应用领域:可用于流式实行,说明书中明白标注经FC实行测试,最好有实行数据图和用量阐明。
抗体克隆号:一样平常挑选参考文献上提到的克隆;统一抗体多个克隆号的状况下,能够挑选荧光符号品种最多的谁人克隆。
2. 肯定流式细胞仪的参数设置
正在设想流式计划前,先肯定需求运用流式细胞仪检测的型号,对该仪器的参数设置要相识以下几个方面信息:
激光器:常见的流式细胞仪有488nm和635nm/633nm两个激光器,但有些机械正在购置时果某些缘由,只装了一个488nm激光器,以是需求注重型号雷同的机械也一定激光设置雷同。
滤光片:也就是有几个检测通道,那决意了您最多能够同时检测几个目标。
仪器的具体型号:有助于再次肯定检测通道。由于同一个荧光正在差别的流式细胞仪上检测,有时候检测通道也是不一样的。
3. 荧光的挑选
挑选曲标照样间标:待测抗原表达下的只管挑选曲标抗体,待测抗原表达丰度低的要思索选间标生物素符号标抗体。
荧光强弱:荧光自己有强弱之分,可视抗原表达强弱及分群状况挑选适宜的荧光。如抗原表达强或分群不明显的发起挑选强荧光比方:PE、APC;反之,抗原表达强或分群显着的发起挑选最常用的强荧光比方FITC便可(常用荧光强弱排序水平为:PE>APC>PE-cy5/Cy5>PerCP/PerCP-Cy5.5/Cy5.5>FITC。
4. 多色荧光搭配的原则
多色剖析计划中荧光抗体的挑选和搭配,会遭到许多身分的制约:
检测通道不克不及抵触:每一个检测通道只能挑选1种荧光素,各通道之间的荧光素能够随便搭配(如FL1挑选了FITC符号的抗体,便不克不及再选择Alexa Fluor488符号的抗体;而同组实行的其他抗体挑选PE大概APC符号,都是能够随便组合的);
荧光强弱:所选种种荧光素光谱的堆叠该当只管削减,不然将会致使较大的赔偿。最常用的4色荧光搭配是:FITC、PE、PerCP/PerCP-Cy5.5、APC;
5. 同型对比抗体的挑选
同型对比(Isotype Control),用于消弭因为抗体非特同性联合到细胞外面而发生的配景染色,是真正意义上的流式阴性对比,流式细胞实行不可或缺的一项。同型对比是运用取一抗雷同种属泉源、雷同亚型及亚链、雷同荧光符号的免疫球蛋白,也要求运用雷同剂量。
纯化级别抗体:若是是纯化的一抗加荧光符号的二抗,那么应当挑选取一抗相对应的同型对比抗体(如样品管为:纯化的CD3+PE符号的二抗+样本;则对看管为:纯化的同型对比+ PE符号的二抗+样本)。

四、流式检测样品的制备
提醒
1、流式细胞仪检测需求将细胞制备成单细胞悬液。
2、制止细胞成团,以避免梗塞流式细胞仪。
3、实体构造制备单细胞悬液需求物理要领星散或酶消化法停止,详细构造的要领,遵照履历去停止。
计划A: 造就细胞的制备
实行质料:0.25%胰,15ml或50ml的离心管。
实行流程:
1、若是是悬浮细胞,则警惕将细胞移入离心管中,停止计数和生机剖析。停止步调3。
2、若是是贴壁细胞,发起运用0.25%的胰酶消化细胞,制备成单细胞悬液后置于离心管上钩数和生机剖析。
3、200g 离心5min。弃去上清,运用适当的流式孵育缓冲液重悬细胞,调解细胞浓度为1×107/ml。
计划B: 组织细胞制备
实行质料取试剂:铰剪和镊子,载玻片, 60×15mm的构造培养皿;细胞过滤器(尼龙网过滤),0.01MPBS。
实行流程:
1、获得构造剪碎或切碎构造为2~4mm碎块,用1XPBS冲刷一遍,只管多的去除构造内血块。
2、将剪碎的构造放正在载玻片磨砂边,滴加两滴1XPBS, 另与一个磨砂边的载玻片停止研磨细胞至粘稠无颗粒物,过滤撤除细胞碎片。
3、加PBS 5ml,200g离心5min,弃去上清。反复洗涤一次,计数和生机剖析。
4、300g 离心5min,弃去上清,运用适当的流式孵育缓冲液重悬细胞,调解细胞浓度为1×107/ml。

五、常见问题取解答
1. 下荧光强度配景
(1)荧光符号的抗体浓度应当适宜,若是浓度过高,配景会由于非特同性相互作用的增添而增添。
(2)正在运用第一抗体之前,将样品取过量的卵白一同培养,如小牛血清卵白(BSA),脱脂干奶酪,或来自于统一寄主的一般血清作为符号的第二抗体。这个步调经由过程阻断第一抗体和细胞外面或胞内构造的非特同性的交互作用去低落配景。
(3)正在运用第一抗体以后,将样品取5%至10%的来自于统一寄主的一般血清和作为符号的第二抗体一同培养。这个步调会削减不必要的第二抗体取第一抗体、细胞外面或胞内构造之间的交互作用。
2. 细胞染色阳性但很强

  (1) 抗细胞因子抗体浓度纰谬大概荧光染料挑选不合适,增添抗体浓度,标本表面抗原表达量低,应当挑选荧光强度下的荧光染料,如PE,APC等。 (2)通透后细胞正在胞内染色前未洗, 按操纵顺序通透后洗细胞再胞内染色。(3)抗体取流动后的胞内抗原亲和力低,需进步抗体浓度。 
3、严峻的细胞丧失  

(1)洗涤离心步调丧失细胞,流动后细胞密度低于活细胞,需用下转速离心,流动通透的细胞离心500g 。(2)加样步调丧失细胞或弃上清带走细胞,应警惕吸样。

六、注意事项
1.  标本处置惩罚:(1)齐血实行  制止运用络合钙的抗凝剂,如ACD取EDTA,由于它们会限定钙依赖性激活历程,推荐用肝素钠。另外LPS,一种常见的生物试剂污染物,是强细胞激活剂,可能会殽杂实验效果。血样正在8小时内剖析,凌驾8小时会致使活性的丧失,一样平常细胞因子阳性细胞会削减5%。如不克不及正在8小时以内检测,应将真空采血管程度室温安排。(2)构造样本制备  与构造时去除构造内凝固的血块。(3)流动,穿膜的试剂PH一定要准确。
2.  挑选适宜的对比:为包管联合的实在和可靠性,最少荧光设置同型对比:用于消弭因为抗体非特同性联合到细胞外面而发生的配景染色;阴性对比(Isotype Control):非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度,应取实验管抗体相对应。正在多色剖析时,同型对照顾与其它抗体同时运用,以制止赔偿形成的偏差。
3.  荧光素的挑选:检测相对低表达细胞因子如IL-4时,应选用PE或APC符号;单检测某一细胞果子时最好也选用PE或APC符号;同时检测多种细胞果子时,强表达的应选用PE或APC,FITC符号最好用于下表达细胞因子如IFN-γ。
4.接纳间接取直接免疫荧光混淆染色法时,原则上先停止直接符号,再停止间接符号。直接符号为细胞内染色时,应当思索流动或透膜剂对间接符号抗体取靶目的的亲和力或靶目的的抗原性的转变等影响,若影响大,则应当先符号间接抗体。

流式检测所需溶液和试剂
1. 1X磷酸盐缓冲液(PBS):将8 g氯化钠(NaCl),0.2 g氯化钾(KCl),1.44 g磷酸氢二钠(Na2HPO4),0.24 g磷酸二氢钾(KH2PO4)消融正在800 ml蒸馏水(dH2O)中。用盐酸调治pH到7.4,定容至1降。室温生存。
2. 4%多聚甲醛溶液(无甲醇的): 100ml单蒸水中到场8g多聚甲醛然后正在水浴锅中加热至50-60℃,到场几滴1mol/L的NaOH边加边搅拌直至悉数消融,消融后置于冰水中冷却至室温,到场100ml的2倍的PBS。调治PH为7.4。
3. 孵育缓冲液:将0.5 g牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)消融正在100 ml的1 X PBS中。生存正在4℃C。

 

 

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